Nativa, Sinop, v. 11, n. 2, p. 207-211, 2023.
Pesquisas Agrárias e Ambientais
DOI: https://doi.org/10.31413/nativa.v11i2.14555
ISSN: 2318-7670
Extratos florais do domínio Cerrado e inibição da acetilcolinesterase
Antonio Carlos Pereira de MENEZES FILHO1* , Matheus Vinícius Abadia VENTURA1,
Ivan ALVES1, Carlos Frederico de Souza CASTRO1, Frederico Antônio Loureiro SOARES1,
Marconi Batista TEIXEIRA1
1Instituto Federal Goiano, Rio Verde, GO, Brasil.
*E-mail: astronomoamadorgoias@gmail.com
Submetido em 26/02/2023; Aceito em 04/07/2023; Publicado em 26/07/2023.
RESUMO: O Cerrado brasileiro possui uma grande diversidade florística ainda pouco estudada sobre os
efeitos e possíveis atividades biológicas de interesse humano, como a inibição da acetilcolinesterase (AChE).
Extratos florais liofilizados de diferentes espécies vegetais produzidos entre 2017-2022, mantidos a -12 °C,
foram utilizados. O método de inibição da acetilcolinesterase utilizada, foi proposto por Ellman, modificado
por Miloševića e colaboradores para leitor de microplacas espectrofotométrico UV-Vis de 96-poços, utilizando
como controle positivo padrão a eserina. Dos 43 extratos florais sobre a inibição de AChE C. regium, J. ulei, O.
spectabilis, O. lancifolia e S. ferrugineus apresentaram as mais altas taxas de inibição > 50%. Os extratos florais de
A. humile, B. forficata, F. florida, H. stigonocarpa, H. courbaril, K. lathrophytum, M. guianensis, P. spruceanum, P. ovatum,
Q. grandiflora, S. grandiflora, S. dysentericus, S. convallariodora, T. stenocarpa e Z. rhoifolium não demonstram nenhuma
atividade sobre AChE. Os achados sobre os extratos florais em diferentes solventes neste estudo, elucidam a
necessidade de um trabalho futuro na separação das fitomoléculas e determinação da atividade de inibição da
AChE, promovendo como novas candidatas a moléculas no desenvolvimento de novos fármacos inibidores de
AChE.
Palavras-chave: Cochlospermum; Tabebuia; inibição enzimática; acetilcolina; Myrcia; Jacaranda; Brosimum; sistema
nervoso.
Cerrado domain floral extracts and acetylcholinesterase inhibition
ABSTRACT: The Brazilian Cerrado has great floristic diversity that is still poorly studied on the effects and
possible biological activities of human interest, such as the inhibition of acetylcholinesterase (AChE).
Lyophilized floral extracts of different plant species produced between 2017-2022, kept at -12 °C, were used.
The acetylcholinesterase inhibition method used was proposed by Ellman, modified by Miloševića and
collaborators for a 96-well UV-Vis spectrophotometric microplate reader, using eserine as a standard positive
control. On the 43 floral extracts on AChE inhibition C. regium, J. ulei, O. spectabilis, O. lancifolia and S. ferrugineus
showed the highest inhibition rates > 50%. Floral extracts of A. humile, B. forficata, F. florida, H. stigonocarpa, H.
courbaril, K. lathrophytum, M. guianensis, P. spruceanum, P. ovatum, Q. grandiflora, S. grandiflora, S. dysentericus, S.
convallariodora, T. stenocarpa and Z. rhoifolium show no activity on AChE. The findings on the floral extracts in
different solvents in this study, elucidate the need for future work in the separation of phytomolecules and
determination of AChE inhibition activity, promoting them as new candidates for molecules in the
development of new AChE inhibitor drugs.
Keywords: Cochlospermum; Tabebuia; enzyme inhibition; acetylcholine; Myrcia; Jacaranda; Brosimum; nervous
system.
1. INTRODUÇÃO
Pesquisas utilizando extratos, óleos essenciais, óleos fixos
e óleos resinas de origem vegetal, vem sendo estudados a
vários anos apresentando resultados satisfatórios sobre a
atividade de inibição da acetilcolinesterase (AChE).
No entanto, devemos voltar aos conceitos sobre
importantes moléculas que trabalham constantemente em
nosso sistema nervoso quer ele central ou periférico. A
acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema
nervoso periférico (SNP), sendo liberada por neurônios
motores do sistema nervoso somático (SNS) e pelo sistema
nervoso autônomo (SNA). A liberação de ACh é realizada
por neurônios pré-ganglionares SNA, pós-ganglionares pelo
sistema nervoso parassimpático (SNPa) e pelos pós-
ganglionares que inervam as glândulas sudoríparas
pertencentes ao SNS (MOTA et al., 2012).
Embora a ACh não esteja limitada ao SNP, esse
neurotransmissor está distribuído por todo o cérebro,
principalmente nas regiões do córtex cerebral, prosencéfalo
basal, hipocampo, diencéfalo, ponte e no cerebelo, esse
último em quantidades inferiores as demais regiões.
Os neurônios colinérgicos apresentam funções
primordiais estando ligados ao alerta, controle motor,
aprendizado e com a memória, onde todas essas funções
exercidas se devem ao neurotransmissor ACh. A falta desse,
desencadeia deficiências, onde isso se deve pela sua baixa ou
Extratos florais do domínio Cerrado e inibição da acetilcolinesterase
Nativa, Sinop, v. 11, n. 2, p. 207-211, 2023.
208
inexistência secreção, desencadeando os severos danos a esse
órgão vital que controla todo o funcionamento do
maquinário no corpo humano ou animal.
A essa falta ou perda de ACh desencadeia efeitos
deletérios, conhecidos por doença de Alzheimer (DA). A DA
causa demência em pacientes, onde nessa fase clínica, os
sintomas cognitivos são suficientemente graves, interferindo
no funcionamento social e nas atividades instrumentais da
vida diária. Essa patologia é gradativa (DUBOIS et al., 2021).
Visto isso, inúmeras fitomoléculas vem apresentando
resultados animadores no tratamento de diversas patologias,
inclusive a DA. Inicialmente, foram desenvolvidas drogas
sintéticas para amenizar ou retardar os sintomas agudos e
crônicos dessa doença, no entanto, os efeitos colaterais o
potenciais podendo causar fortes efeitos indesejáveis em
outros órgãos. Com isso, pesquisas com plantas medicinais
vem apresentando resultados superiores as primeiras drogas
empregadas no tratamento da DA (MASONDO et al., 2019;
NEVES et al., 2022).
Conforme sugere Neves et al. (2022) um grupo alvo de
fitomoléculas com diversas utilidades (compostos fenólicos)
agem nas fronteiras das biomoléculas como redutores de
radicais livres (RL), esses, altamente reativos que
desencadeiam nos processos biológicos de doenças como a
DA.
Este estudo objetivou-se avaliar in vitro diferentes extratos
vegetais a partir do órgão floral de espécies vegetais do
domínio Cerrado, estes, obtidos por solventes (aquoso,
hidroetanólico 70% e etanólico 98%) sobre a atividade de
inibição da acetilcolinesterase.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Reagentes e equipamentos
Enzima Acetilcolinesterase tipo VI (200-1.000 unid./mg-
1) obtida de Electrophorus electricus (Sigma-Aldrich®),
Acetilcolina iodada (Sigma-Aldrich®), 5,5’-Ditiobis (Ácido 2-
nitrobenzóico) (Sigma-Aldrich®), Salicilato de Fisostigmina
(eserina) (Sigma-Aldrich®), tampão Tris-HCl (Sigma-
Aldrich®), albumina bovina sérica (Sigma-Aldrich®), Álcool
Metílico grau (P.A ACS) (Neon), Álcool Etílico grau (P.A
ACS) (Neon), Fosfato de dio monossódico grau (P.A
ACS) (Neon).
Sistema de purificação de água Milli-Q® Direct 8,
micropipeta variável monocanal 0,5-10 e 10-100 µL (Labmate
Pro, Htl®), placa de Elisa 96-poços fundo chato com tampa,
estéril (Global Plast®), Leitora automática de microplacas
espectrofotométrico UV-Vis (Polaris, Glasslab®), Vials 5 mL
(Mylabor®).
2.2. Extratos florais
Os extratos florais aquoso, hidroetanólico 70% (v/v) e
etanólico 98% (v/v) liofilizados, foram cedidos pelo
Laboratório de Química Tecnológica pertencente ao
Programa de Pós-Graduação em Agroquímica no Instituto
Federal Goiano, Campus Rio Verde, Estado de Goiás, Brasil
(IF Goiano). Todas as espécies vegetais pertencentes ao
domínio Cerrado foram coletadas em áreas de Cerrado
fitofisionomia Cerradão, Cerrado sentido restrito e Cerrado
rupestre localizados na região Sudoeste de Goiás entre 2017-
2022 e mantidos sobre refrigeração a -12 °C.
As espécies possuem Vouchers depositados nos
Herbários: Laboratório de Sistemática Vegetal pertencente ao
Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e
Conservação pelo IF Goiano, localizado no mesmo Campus;
Herbário Jataiense na Universidade Federal de Jataí, Campus
Jatobá, Jataí, Goiás, Brasil, e Herbário do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás,
Campus Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil.
Na Tabela 1 são apresentadas as espécies vegetais
utilizadas na forma de extratos para avaliação da atividade
inibitória da enzima AChE.
Tabela 1. Espécies vegetais utilizadas no ensaio de inibição de
acetilcolinesterase.
Table 1. Plant species used in the acetylcholinesterase inhibition
assay.
Nome científico
Voucher
Anadenanthera peregrina
(L.) Speg.
Anacardium humile
A. St.
-
Hil.
842
Bauhinia forficata
Link
Bauhinia monandra
Kurz
Bauhinia rufa
(Bong.) Steud.
1116
Byrsonima verbascifolia
(L.) DC.
958
Byrsonima coccolobifolia
Kunth.
2.071
Brosimum gauudichaudii
Trecul.
1.993
Curatella americana
Linn
Cochlospermum regium
(Mart. ex Schrank.) Pilger
844b
Eugenia pyriformis
Cambess
13457
Fridericia platyphylla
(Cham.) LG. Lohmann
Fridericia florida
(DC.) LG. Lohmann
1.984
Himatamthus obovatus
(Muell. Arg.) Woodson
Hymenaea stigonocarpa
Mart. ex Hayne
1.011
Hymenaea courbaril
L.
1.924
Jacaranda cuspidifolia
Mart.
1.566
Jacaranda ulei
Bureau & K. Schum.
Kielmeyera lathrophytum
Saddi
2.937
Mandevilla pohliana
(Stadelm.) A. H. Gentry
Miconia chamissois
Naudin
1.987
Myrcia guianensis
(Aubl.) DC.
Myrciaria glazioviana
3.997
Ouratea spectabilis
1.923
Ouratea lancifolia
R. G. Chacon & K. Yamam.
1.671
Protium spruceanum
(Benth.) Engl.
Protium ovatum
Engl.
628
Qualea grandiflora
Mart.
Raulinoreitzia crenulata
1.675
Ruellia brevifolia
(Pohl.) C. Ezcurra
2.077
Schubertia grandiflora
Mart. & Zucc.
1.989
Stenocalyx dysentericus
3.652
Schinus molle
L.
1.210
Schinus terebinthifolius
Salvertia convallariodora
A. St.
-
Hil.
2.047
Styrax ferrugineus
Nedd & Mart.
1.056
Spiranthera odoratissima
A. St.
-
Hil.
1.039
Solanum lycocarpum
St.
-
Hil.
1.061
Tabebuia impetiginosa
(Mart. ex DC.) Standl.
1.284
Tabebuia roseoalba
(Ridl.) Sandwith
2.033
Tabebuia
serratifolia
(Vahl.) G. Nichols
3.034
Tibouchina stenocarpa
(Schrank & Mart. Ex DC.)
Cogn.
1.988
Zanthoxylum rhoifolium
(Lam.)
1.075
Nota: Todas as espécies vegetais utilizadas, foram identificadas pelo primeiro
autor deste estudo.
Note: All plant species used were identified by the first author of this study.
2.3. Ensaio de inibição de AChE
O método colorimétrico para determinação da inibição
da AChE seguiu conforme proposto por Miloševića et al.
(2020). A enzima conc. (0,09 U mL-1), iodeto de acetilcolina
conc. (0,014 M) e DTNB (0,01 M) foram dissolvidos em
solução tampão fosfato conc. (0,1 M, pH = 8), e os extratos
diluídos conc. 1 mg mL-1 em solução tampão fosfato +
Menezes Filho et al.
Nativa, Sinop, v. 11, n. 2, p. 207-211, 2023.
209
DMSO a 10% (v/v). Diluições dos extratos em série (40 μL)
foram preparados diretamente em microplaca de 96 poços,
de modo que a faixa de concentração no volume final fosse
entre 0,4-400 μM.
As soluções foram ajustadas para 160 μL com tampão
fosfato (0,1 M, pH = 8) e a enzima foi adicionada (20 μL).
Após 15 min de incubação em D.B.O. sem fotoperíodo a 25
ºC, foi adicionado alíquotas de DTNB (10 μL) e AChE (10
μL) aos poços. Em seguida, as placas foram homogeneizadas
e a incubação continuou por mais 40 min. A absorbância
(Abs) foi lida em 405 nm, em leitor de microplacas UV-Vis.
Como branco, foi utilizado as soluções de tampão fosfato
(180 μL) e DTNB (10 μL) e AChE (10 μL). A atividade
enzimática máxima foi obtida pela substituição das amostras
pela solução de tampão fosfato DMSO a 10% e a Abs dos
extratos pela substituição da solução enzimática por tampão
fosfato. Uma solução de eserina conc. (10 µM) foi usada
como controle positivo (inibidor padrão). A porcentagem
(%) de inibição da reação enzimática foi calculada de acordo
com a equação 1:
AChE (%) = [(A-B)-(C-D)]
(A-B) *100 (01)
em que: A, B, C e D são as absorbâncias da atividade enzimática
máxima, branco de reação, atividade enzimática na presença das
amostras e a cor das soluções das amostras, respectivamente. O
ensaio de AChE foi realizado em triplicata.
2.4. Análise estatística
A atividade enzimática e o percentual de inibição da
AChE foram calculados utilizando programa Excel® (versão
365 da Microsoft). A diferença estatística foi adotada
utilizando teste de Student com P < 0,05 de confiabilidade
utilizando o programa Sisvar.
3. RESULTADOS
A Tabela 2 apresenta os percentuais de inibição de AChE
para os extratos florais aquoso, hidroetanólico 70% e
etanólico 98%. Dos 43 extratos florais sobre a inibição de
AChE, C. regium, J. ulei, O. spectabilis, O. lancifolia e S. ferrugineus
apresentaram as mais altas taxas de inibição. Os extratos
florais de A. humile, B. forficata, F. florida, H. stigonocarpa, H.
courbaril, K. lathrophytum, M. guianensis, P. spruceanum, P. ovatum,
Q. grandiflora, S. grandiflora, S. dysentericus, S. convallariodora, T.
stenocarpa e Z. rhoifolium o demonstram nenhuma atividade
sobre AChE.
4. DISCUSSÃO
Extratos florais cuja inibição sobre AChE foi maior que
50% demonstram aptidão para fracionamento por
cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em
coluna (CC) e quantificação dos teores das fitomoléculas
comparadas a padrões por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) (MOTA et al., 2002).
Ainda, o poucos os estudos que avaliam extratos florais
ou capítulos florais sobre a inibição de AChE. Em nossos
achados literários, nos deparamos com os estudos de Oliveira
et al. (2021) com extrato etanólico floral de Bauhinia monandra
(Fabaceae) por microdiluição (positiva) e intensidade de
inibição moderada, e Marques et al. (2013) onde os
pesquisadores encontraram atividade de inibição sobre
AChE positiva e intensidade alta no método in vivo, a partir
do extrato etanólico floral de Bellis perennis (Asteraceae).
Resultados animadores também foram obtidos por Feitosa et
al. (2011) para Bougainvillea glabra (Nyctaginaceae), Ipomoea
asarifolia (Convolvulaceae), Cassia fistula (Fabaceae) e
Phyllanthus amarus (Euphorbiaceae) a partir dos extratos
metanólicos florais por microdiluição onde os pesquisadores
encontraram atividade positiva e intensidade alta sobre
inibição da AChE.
Tabela 2. Inibição e classificação da intensidade de inibição de
AChE pelos extratos hidroetanólico 70% e etanólico 98% floral de
espécies vegetais do Cerrado.
Table 2. Inhibition and classification of AChE inhibition intensity
by 70% hydroethanolic and 98% floral ethanolic extracts from
Cerrado plant species.
Nome cient
ífico
(%) de inibição
de AChE
Intensidade
de inibição
A. peregrina
43
b
Moderada
A. humile
-
a
Inexistente
B. forficata
-
b
Inexistente
B. monandra
18
b
Fraca
B. rufa
23
c
Fraca
B. verbascifolia
18
c
Fraca
B. coccolobifolia
17
b
Fraca
B.
gauudichaudii
28
b
Fraca
C. americana
10
b
Fraca
C. regium
78
b
Potente
E. pyriformis
15
c
Fraca
F. platyphylla
41
c
Moderada
F. florida
-
a
Inexistente
H. obovatus
14
b
Fraca
H. stigonocarpa
-
b
Inexistente
H. courbaril
-
b
Inexistente
J.
cuspidifolia
35
b
Moderada
J. ulei
62
b
Potente
K. lathrophytum
-
a
Inexistente
M. pohliana
33
b
Moderada
M. chamissois
13
b
Fraca
M. guianensis
-
c
Inexistente
M. glazioviana
11
b
Fraca
O. spectabilis
93
b
Potente
O. lancifolia
90
b
Potente
P.
spruceanum
-
a
Inexistente
P. ovatum
-
a
Inexistente
Q. grandiflora
-
b
Inexistente
R. crenulata
16
b
Franca
R. brevifolia
8
c
Franca
S. grandiflora
-
a
Inexistente
S. dysentericus
-
c
Inexistente
S. molle
12
c
Fraca
S. terebinthifolius
7
c
Fraca
S.
convallariodora
-
a
Inexistente
S. ferrugineus
97
b
Potente
S. odoratissima
-
c
Inexistente
S. lycocarpum
16
b
Fraca
T. impetiginosa
48
b
Moderada
T. roseoalba
6
b
Fraca
T. serratifolia
27
b
Fraca
T. stenocarpa
-
a
Inexistente
Z.
rhoifolium
-
a
Inexistente
Nota: Atividade Inexistente (-). Atividade Fraca (< 30%). Atividade
Moderada (> 30 até 50%). Atividade Potente (> 50%). (a) Extrato Aquoso.
(b) Extrato Hidroetanólico 70%. (c) Extrato Etanólico 98%.
Note: Non-existent Activity (-). Weak Activity (< 30%). Moderate Activity
(> 30 at 50%). Powerful Activity (> 50%). (a) Aqueous Extract. (b)
Hydroethanolic Extract 70%. (c) Ethanol Extract 98%.
Óleo essencial floral extraído pelo método de
hidrodestilação em aparato de Clevenger nos estudos com
Extratos florais do domínio Cerrado e inibição da acetilcolinesterase
Nativa, Sinop, v. 11, n. 2, p. 207-211, 2023.
210
Lantana camara (Verbenaceae) por Santos et al. (2015) e em
Pelargonium x ssp. (Geraniaceae) por microdiluição (Lima et
al., 2021), apresentaram atividade positiva e intensidade alta
sobre a inibição de AChE.
Além dos extratos e óleos essenciais florais, outros órgãos
de inúmeros vegetais nos mais diversos tipos de solventes
extratores, frações e subfrações desses, demonstraram fraca,
média e alta capacidade de inibição dessa enzima, como se
observa em um estudo de revisão proposto por Lopes et al.
(2022), e apresentados por Hassan et al. (2018) e Zaidi et al.
(2019). Complementando sobre o uso de extratores
químicos, o etanol apresentou ser o solvente com melhor
resultado na obtenção de um número considerável de grupos
de fitomoléculas em extratos vegetais diversos, seguido de
metanol, acetato de etila, água, solução hidroetanólica 70% e
n-hexano.
Ainda nesse estudo retrospectivo, o órgão floral não seja
inexistente entre os demais órgãos, Lopes et al. (2022)
reportam que para capítulos florais apresenta 2% e para flores
8% do total de estudos, embora ainda baixos quando
comparados a outros órgãos de um vegetal como galhos
37%, folhas 94%, bulbo 22% e 21% partes aéreas em seu
levantamento bibliográfico.
O ensaio de atividade sobre AChE mais utilizado, é o de
microplacas de 96 poços, essa resposta aos nossos achados,
corrobora com Lopes et al. (2022) onde em um levantamento
dos métodos obteve resultado de 54,17%. Além disso, a
economia dos reagentes que na maioria são de alto custo,
gera-se também resultados rápidos em um tempo diminuto.
Uma microplaca é capaz de fazer dezenas de ensaios de
inibição enzimática ao mesmo tempo e isso proporciona
também menor tempo nos resultados e escolha de possíveis
extratos e óleos candidatos a testes mais sensíveis in vivo por
exemplo, na busca da fitomolécula responsável pela alta
capacidade de inibir a AChE.
5. CONCLUSÕES
Nossos achados permitem concluir que os extratos
aquoso, hidroetanólico 70% e etanólico 98% apresentam
efetiva ação de inibição da AChE na maioria dos extratos
florais avaliados. Estudos futuros devem ser realizados sobre
a partição e purificação das frações para que se possa isolar
através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou
cromatografia líquida de alta eficiência por contracorrente
(CLAE-CC) as moléculas responsáveis pela atividade
inibitória de acetilcolinesterase.
6. REFERÊNCIAS
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Agradecimentos: Ao Instituto Federal Goiano; aos Laboratórios
de Biomoléculas e Bioensaios, Águas e Efluentes e de Química
Tecnológica; a Central Multiusuário Analítica; aos órgãos de
fomento em pesquisa, CAPES Centro de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior, FINEP Financiadora de Projetos e
Pesquisas, CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico e FAPEG Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de Goiás.
Contribuição dos autores: A.C.P.M.F; M.V.A.V. metodologia,
coleta vegetal, coleta de dados, produção dos extratos, atividade
experimental, análise estatística, escrita, submissão e publicação; I.A.
correção escrita, leitura científica. C.F.S.C. metodologia de
inibição da AChE. F.A.L.S.; M.B.T. orientador e coorientador,
obtenção de financiamento, supervisão e redação final.
Financiamento: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de
Goiás – FAPEG (Bolsa de Doutorado para o primeiro autor).
Revisão por comitê institucional: Não se aplica.
Comitê de Ética: Não se aplica.
Disponibilização de dados: Os dados desse estudo podem ser
obtidos mediante solicitação ao autor correspondente ou primeiro
autor, através do e-mail (astronomoamadorgoias@gmail.com).
Conflito de Interesse: Os autores declaram que não existem
conflitos de interesse com outros pesquisadores ou instituições.